Известия Саратовского университета. Новая серия.

Серия Химия. Биология. Экология

ISSN 1816-9775 (Print)
ISSN 2541-8971 (Online)

Для цитирования:

Красова Ю. В., Фадеев В. В., Моисеева Е. М., Гусев Ю. С., Чумаков М. И. Оптимизация методики получения протопластов кукурузы и их нативность после электропорации // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2022. Т. 22, вып. 4. С. 445-454. DOI: 10.18500/1816-9775-2022-22-4-445-454, EDN: UTPGJS

Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY 4.0).
Полный текст в формате PDF(Ru):
скачать
(загрузок: 184)
Полный текст в формате PDF(En):
скачать
(загрузок: 57)
Язык публикации: 
русский
Рубрика: 
Биология
Тип статьи: 
Научная статья
УДК: 
576.08.572.22
DOI: 
10.18500/1816-9775-2022-22-4-445-454
EDN: 
UTPGJS

Оптимизация методики получения протопластов кукурузы и их нативность после электропорации

Авторы: 
Красова Юлия Викторовна, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук”(ИБФРМ)
Фадеев Владимир Васильевич, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук”(ИБФРМ
Моисеева Елизавета Михайловна, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук”(ИБФРМ)
Гусев Юрий Сергеевич, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук”
Чумаков Михаил Иосифович, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов – обособленное структурное подразделение Федерального исследовательского центра “Саратовский научный центр Российской академии наук”
Аннотация: 

Приведены результаты оптимизации методики изоляции протопластов из эпидермальных клеток корней кукурузы (Zea mays L.) линии Коричневый маркер (KM), в ходе которой были проведены скрининговые исследования по подбору состава и концентрации ферментов, соотношения времени ферментативной обработки растительного материала и объема ферментной смеси, концентрации осмотического агента, режима центрифугирования и размера пор фильтра, применяемого при очистке суспензии протопластов. Выявлено, что оптимальное время для мацерации корневой ткани массой ~ 150 мг – 150 минут. Выход интактных протопластов составил ~ 4,4 ± 0,2 × 105 кл/мл при следующих концентрациях ферментов и осмотического стабилизатора: целлюлаза – 17,4, пектолаза – 1,2, гемицеллюлаза – 0,07, D-маннит – 9,3%. Концентрация протопластов была в 23 раза выше (р < 0,05) при обработке растительной ткани в объеме 800 мкл ферментной смеси по сравнению с 200 мкл при равных концентрациях ферментов и осмотического стабилизатора. Установлено, что фильтрация 800 мкл суспензии протопластов через фильтр с размерами пор 15×15 мкм увеличивает в 3,3 раза выход протопластов при концентрации ферментов: целлюлаза – 8,7, пектолаза – 0,6, гемицеллюлаза 0,035% по сравнению с фильтром с размерами пор 15×39 мкм. Дробное центрифугирование без предварительной фильтрации раствора и метод флотации не увеличивали количество протопластов при очистке суспензии от дебриса. В рамках исследования была проведена оценка остаточного количества протопластов и определена их сохранность после инкубации в течение ~ 20 ч при +3 °C. После электропорации наблюдалось достоверное (р < 0,05) уменьшение количества протопластов в 2 раза.

Ключевые слова: 
протопласты
кукуруза
электропорация
нативность протопластов
Список источников: 
  1. Davey M. R., Anthony P., Patel D., Power J. B. Plant protoplasts: isolation, culture and plant regeneration // Plant Cell Culture: Essential Methods. New York : WileyBlackwell, 2010. P. 153–173.
  2. Bailey-Serres J., Dawe R. K. Both 5’ and 3’ sequences of maize adh1 mRNA are required for enhanced translation under low-oxygen conditions // Plant Physiol. 1996. Vol. 112. P. 685–695. https://doi.org/10.1104/pp.112.2.685
  3. Кудряшов А. П., Шапчиц М. П. Оценка нативности протопластов и клеток растений // Труды Белорусского государственного университета: научный журнал. 2009. Т. 4, № 2. С. 1–6.
  4. Maccarrone M., Veldink G. A., Agro A. F., Vliegenthart J. F. G. Lentil root protoplasts, a transient expression system suitable for coelectroporation of monoclonal antibodies and plasmid molecules // Biochem. Biophys. Acta. (BBA). 1995. Vol. 1243. P. 136–142. https://doi. org/10.1016/0304-4165(94)00124-G
  5. Jang J.-C., Sheen J. Sugar sensing in higher plants // Plant Cell. 1994. Vol. 6. P. 1665–1679. https://doi.org/10.1105/ tpc.6.11.1665
  6. Ziv M., Altman A. Tissue culture General Principles // Encyclopedia of Applied Plant Sciences Elsevier Science Ltd. 2003. P. 1341–1353. https://doi.org/10.1016/B0-12- 227050-9/00213-1
  7. Reed K. M., Bargmann B. O. R. Protoplast regeneration and its use in new plant breeding technologies // Frontiers in Genome Editing. 2021. Vol. 3. P. 1–26. https://doi. org/10.3389/fgeed.2021.734951
  8. Скапцов M. В., Смирнов С. В., Куцев М. Г. Получение протопластов облепихи (Hippophae rhamnoides L.) // Turczaninowia. 2013. Т. 16, № 3. С. 152–156. https://doi.org/10.14258/turczaninowia.16.3.20
  9. Papadakis A., Reustle G., Roubelakis-Angelakis K. A. Protoplast technology in grapevine // Molecular Biology & Biotechnology of the Grapevine. Springer, Dordrecht, 2001. Ch. 14. P. 353–392. https://doi.org/10.1007/978-94-017-2308-4_14
  10. Cocking E. A. Method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles // Nature. 1960. Vol. 187. P. 962–963.
  11. Bhojwani S. S., Razdan M. K. Protoplast isolation and culture // Studies in Plant Science. 1996. Vol. 5, ch. 12. P. 337–372.
  12. Кузнецова Е. А., Парамонов И. Н., Зомитев В. Ю. Оценка использования ферментов целлюлазного комплекса при получении протопластов растений // Технология и товароведение инновационных пищевых продуктов. 2013. № 5. С. 9–12.
  13. Gronwald J. W., Leonard R. T. Isolation and transport properties of protoplasts from cortical cells of corn roots // Plant Physiology. 1982. Vol. 70, № 5. P. 1391–1395.
  14. Perlin D. S., Spanswick R. M. Labeling and isolation of plasma membranes from corn leaf protoplasts // Plant Physiology. 1980. Vol. 65, № 6. P. 1053–1057.
  15. Senn A., Pilet P. E. Isolation and some morphological properties of maize root protoplasts // Zeitschrift für Pfl anzenphysiologie. 1980. Bd. 100, № 4. S. 299–310.
  16. Скапцов М. В., Куцев М. Г. Получение мезофильных протопластов Rumex aquaticus и Rumex acetosa сорт «широколистный» // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии. 2011. № 10. С. 170–173.
  17. Ochatt S. J., Caso O. H. Shoot regeneration from leaf mesophyll protoplasts of wild pear (Pyrus communis var. pyraster L.) // Journal of Plant Physiology. 1986. Vol. 122, № 3. P. 243–249. https://doi.org/10.1016/S0176-1617(86)80123-7
  18. Молчан О. В., Ромашко С. Н., Кенькова М. А., Юрин В. М. Иммобилизация протопластов мезофилла листа Catharanthus roseus // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. 2010. № 4. С. 45–49.
  19. Rao K. S., Prakash A. H. A simple method for the isolation of plant protoplasts // Journal of Biosciences. 1995. Vol. 20. P. 645–655. https://doi.org/10.1007/BF02703304
  20. Evans D. A., Bravo J. E. Plant protoplast isolation and culture // Intern. Rev. Cytol. Suppl. 2013. Vol. 16. P. 33–53.
  21. Прилепский А. Ю., Дроздов А. С., Богатырев В. А., Староверов С. А. Методы работы с клеточными культурами и определение токсичности наноматериалов. СПб. : Университет ИТМО, 2019. 43 с.
  22. Kanchiswamy C. N. DNA-free genome editing methods for targeted crop improvement // Plant Cell Rep. 2016. Vol. 35. P. 1469–1474.
  23. Woo J. W., Kim J., Kwon S. I., Corvalán C., Cho S. W., Kim H., Kim S.-G., Kim S.-T., Choe S., Kim J.-S. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins // Nat. Biotechnol. 2015. Vol. 33. P. 1162–1164. https://doi.org/10.1038/nbt.3389
  24. Malnoy M., Viola R., Jung M. H., Koo O.-J., Kim S.,Kim J.-S., Velasco R., Kanchiswamy C. N. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using Crispr/Cas9 ribonucleoproteins // Frontiers Plant Sci. 2016. Vol. 7, № 1904. P. 1–9. https://doi.org/10.3389/ fpls.2016.01904
  25. Andersson M., Turesson H., Olsson N., Fält A.-S., Ohlsson P., Gonzalez M. N., Samuelsson M., Hofvander P. Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery // Physiol. Plant. 2018. Vol. 164, № 4. P. 378–384. https://doi.org/10.1111/ppl.12731
  26. Liang Z., Chen K., Gao C. Biolistic delivery of CRISPR/ Cas9 with ribonucleoprotein complex in wheat // Methods Mol. Biol. 2019. Vol. 1917. P. 327–335. https:// doi.org/10.1007/978-1-4939-8991-1_24
  27. Kim H., Kim S. T., Ryu J., Kang B.-C., Kim J.-S., Kim S.-G. CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing // Nat. Commun. 2017. Vol. 8, № 14406. P. 1–7. https://doi.org/ 10.1038/ncomms14406
  28. Данилова С. А. Методы генетической трансформации зерновых культур // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 5. С. 645–658.
  29. Чесноков Ю. В. Проблемы генетической трансформации растений. Методические подходы (обзор) // Сельскохозяйственная биология. 2004. Т. 39, № 1. С. 26–40.
  30. Fromm M., Taylor L. P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1985. Vol. 82, № 17. P. 5824–5828.
  31. Bates G. W. Plant transformation via protoplast electroporation // Plant Cell Culture Protocols. 1999. Vol. 111. P. 359–366. https://doi.org/10.1385/1-59259- 583-9:359
  32. Rhodes C. A., Pierce D. A., Mettler I. J., Mascarenhas D., Detmer J. J. Genetically transformed maize plants from protoplasts // Science. 1988. Vol. 240, № 4849. P. 204–207. https://doi.org/10.1126/science.283294
  33. Gomez-Cano L., Yang F., Grotewold E. Isolation and effi cient maize protoplast transformation // Bio-protocol. 2019. P. e3346–e3346. https://doi.org/10.21769/ BioProtoc.3346
  34. Lyznik L. A., Kamo K. K., Grimes H. D., Ryan R., Chang K.-L. Hodges T. K. Stable transformation of maize: The impact of feeder cells on protoplast growth and transformation effi ciency // Plant Cell Reports. 1989. Vol. 8. P. 292–295. https://doi.org/ 10.1007/ BF00274133
  35. Chase S. S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.) // The Botanical Review. 1969. Vol. 35, № 2. P. 117–168. https://doi.org/10.1007/BF02858912
  36. Ortiz-Ramírez C., Arevalo E. D., Xu X., Jackson D. P., Birnbaum K. D. An effi cient cell sorting protocol for maize protoplasts // Current Protocols in Plant Biology. 2018. Vol. 3, № 3. P. e20072. https://doi.org/10.1002/cppb.20072
  37. Пескова Н. Н., Балалаева И. В., Брилкина А. А., Шилягина Н. Ю., Масленникова А. В., Мысягин С. А. Оценка жизнеспособности клеток in vitro: учеб.- метод. пособие. Нижний Новгород : Нижегородский госуниверситет, 2020. 25 с.
Поступила в редакцию: 
03.08.2022
Принята к публикации: 
11.08.2022
Опубликована: 
23.12.2022
Краткое содержание:
скачать
(загрузок: 67)